Laboratorio Integrado I --> SIMULACIÓN 1 --> Procesos de purificación de enzimas.
En esta práctica de simulación el alumno debe utilizar los conocimientos teóricos sobre distintas técnicas utilizadas en la purificación de proteínas para aislar una posible proteína objeto de posteriores estudios funcionales, estructurales, etc.
Se utilizará un programa sencillo de ejecución en MS-DOS. Este programa se ejecuta sobre la aplicación DOSbox. Debes descargar en tu disco duro y descomprimir el fichero DOSBOX.rar sobre el disco C:\ en una carpeta c:\dosprog\
El fichero ejecutable es "proteins.com". El programa permite purificar (o al menos intentarlo) 20 proteínas.
En la figura siguiente puedes ver todos los ficheros y carpetas que se generan después de descomprimir DOSbox.
Para ejecutar DOSbox abre la carpeta DOSbox-0.73 y veras todos los ficheros que contiene, según se muestra en la siguiente figura.
Debes hacer doble click sobre el fichero dosbox.exe y se ejecutará la apertura de un entorno de MS-DOS en el que además está instalado un Windows 3.11. Debes moverte entre directorios con la sintáxis de comandos típica de MS-DOS.
El fichero ejecutable es "proteins.com". El programa permite purificar (o al menos intentarlo) 20 proteínas. La pantalla inicial de ejecución de este programa se puede ver en la siguiente figura.
OBJETIVOS
Empleando tus conocimientos acerca de técnicas bioquímicas de purificación de proteínas, puedes utilizar este programa para purificar las 20 enzimas. Para esta práctica debes purificar las enzimas 9, 13 y 19. Se pedirá un pequeño informe (en formato PDF) en el que se relate las etapas seguidas y el informe final que presenta el propio programa cuando se lleva a cabo la purificación.
Tutorial
Te presentamos la purificación de la PROTEÍNA 13. En esta "empresa" el mejor bioquímico invierte el menor número de etapas de purificación, lo que en el laboratorio real supone menor costo económico en reactivos y materiales y menor tiempo de dedicación del investigador. Siempre debes tener presente la sentencia "Time is money".
Partes de una solución que tiene 511 mg de proteína. En ella puedes purificar alguna de las 20 enzimas diferentes, utilizando distintas técnicas de separación ... Para avanzar pulsa la barra espaciadora.
Comienza el trabajo de laboratorio ...
Elija la enzima a purificar ... en este caso la número 13.
La información de partida sobre este enzima es ...
Realizamos una precipitación con sulfato amónico al 5-50 % de saturación.
En esta esta etapa conseguimos eliminar el 47.2 % de la proteína que queda en la fracción soluble. En la fracción precipitada queda la enzima que nos interesa.
Continuamos utilizando el material precipitado ...
Resultado después de la primera etapa ...
Continua el proceso de purificación. Realizamos ahora una cromatografía de intercambio iónico: CM-celulose. El buffer para equilibrar la columna debe tener pH 7.0 La columna se eluye con un gradiente de pH entre 7 y 10.
Ensayamos la actividad enzimática y recogemos las fracciones adecuadas, en este caso las fracciones 100 a 125, ya que es donde detectamos el pico de actividad.
Los resultados después de la 2 etapa de prificación son:
Recogemos las fracciones 100 a 125 y realizamos una electroforesis SDS-page para comprobar si nuestra enzima está purificada:
Aun tenemos una proteína contaminante. Procede hacer una tercera etapa de purificación. Pensando en que ambas proteínas tienen un peso molecular difícil de resolver por filtración en gel, para purificar la enzima de interés de la proteína contaminante sugerimos la utilización de una técnica de isoelectroenfoque. Así utilizaremos sus propiedades ácido-base en la purificación final.
Comprobamos que la actividad enzimática corresponde a las fracciones del primer pico de absorbancia, colectamos esas fracciones y en la siguiente pantalla se presentan los resultados después de la tercera etapa de purificación.
La electroforesis en gel SDS-PAGE revela que tenemos nuestra enzima purificada.
