Laboratorio Integrado I --> SIMULACIÓN 2 --> Fraccionamiento subcelular.
La práctica de fraccionamiento subcelular consiste en el aislamiento de una fracción problema (mitocondrias, núcleos, cloroplastos, retículo endoplásmico, peroxisomas, lisosomas, etc.) a partir de distintos materiales (hígado de rata, cultivos de tejidos celulares y hoja de espinaca), con la técnica que ofrece el programa, la CENTRIFUGACIÓN.
Se utilizará un programa sencillo de ejecución en MS-DOS. Este programa se ejecuta sobre la aplicación DOSbox. Debes descargar en tu disco duro y descomprimir el fichero DOSBOX.rar sobre el disco C:\ en una carpeta c:\dosprog\
En la figura siguiente puedes ver todos los ficheros y carpetas que se generan después de descomprimir DOSbox.
Para ejecutar DOSbox abre la carpeta DOSbox-0.73 y veras todos los ficheros que contiene, según se muestra en la siguiente figura.
Debes hacer doble click sobre el fichero dosbox.exe y se ejecutará la apertura de un entorno de MS-DOS en el que además está instalado un Windows 3.11. Debes moverte entre directorios con la sintáxis de comandos típica de MS-DOS.
El fichero ejecutable es "subcell.com". La pantalla inicial de ejecución de este programa se puede ver en la siguiente figura.
OBJETIVOS
Los objetivos a alcanzar son los siguientes:
- Aprender el manejo del programa. Ensayar diversas situaciones y distintas condiciones. Identificación gráfica de cada uno de los orgánulos que aparecen en los distintos materiales y con distintas fracciones.
- Obtención de peroxisomas.
- Obtención de cloroplastos.
La calificación se llevará a cabo según criterios de máxima pureza en el menor tiempo posible. Como ayuda se incluyen en el apartado Apéndice algunos gráficos y tablas que aparecen en "Biological Membranes: a practical approach". IRL Press. Oxford. 1987.
Tutorial
A continuación se muestra un ejemplo de manejo del programa para la purificación de mitocondrias. Como bibliografía de referencia se recomienda el libro: "Biological Membranes: a practical approach", J.B.C Findlay & W.H. Evans, eds. IRL Press. Oxford. 1987. ISBN: 0-947946-83-7. Se debe ejecutar el programa SUBCELL.com en el ordenador local.
Después de la pantalla de presentación aparecerá la de instrucciones:
La BARRA ESPACIADORA y el ENTER son las teclas más importantes, ya que se van a utilizar para seleccionar las opciones y para ejecutarlas, respectivamente.
El programa ofrece la posibilidad de empezar desde el principio o a partir de un material previamente grabado.
Ahora deberemos seleccionar un tejido.
y una fracción subcelular
A la pregunta del recuadro le contestaremos que NO
El método de rotura elegido es
Durante el tiempo especificado
Elegimos el tipo de centrifugación
El modelo de rotor
El modelo de centrifuga
La temperatura de centrifugación
AHORA EL EJEMPLO DE AISLAMIENTO DE LAS MITOCONDRIAS NOS DA LA POSIBILIDAD DE INTRODUCIR PARÁMETROS QUE CONDUCEN A UNA BUENA PREPARACIÓN, O POR EL CONTRARIO, A UNA MALA PREPARACIÓN DE MITOCONDRIAS DE HÍGADO DE RATA
BUENA PREPARACIÓN
Velocidad de giro de la centrífuga
Tiempo especificado
Aparecerá un panel de centrífuga que nos indica el proceso
Obtendremos un sobrenadante y un sedimento, así como el número de mg de proteína en cada uno de ellos. Seleccionar un ensayo enzimático adecuado para determinar dónde se encuentra la fracción de interés. En nuestro caso será la succinato deshidrogenasa.
El resultado del ensayo enzimático determina que la mayoría de las mitocondrias se encuentran en el sobrenadante, habiendo separado los núcleos (en el sedimento). Recoger fracciones.
Seleccionamos el sobrenadante
Elegimos ver qué aspecto .tiene el sobrenadante en esta etapa intermedia. Elegimos la microscopía electrónica.
El aspecto del sobrenadante es el de la figura. Las mitocondrias aún no están bien aisladas, deberemos llegar a un segundo paso de purificación.
Ahora vamos al paso siguiente "Go to next step".
Nuestro sobrenadante lo sometemos a una centrifugación en gradiente de sacarosa
Con el tipo de rotor
Y con el modelo de rotor
Nos pedirá un volumen de sacarosa para llenar los tubos. Elegimos 25 ml
El balance de volúmenes nos invita a continuar o a elegir otro rotor
Establecemos el rango del gradiente
Establecemos la temperatura de centrifugación
Establecemos la velocidad
Establecemos el tiempo de centrifugación
Aparece el panel de la centrífuga
Y finalmente un resumen de la centrifugación que acabamos de hacer
Obtenemos un perfil de migración en el gradiente de sacarosa midiendo la absorbancia de las fracciones a 280 nm (verde). Cuando le pedimos que mida la actividad de la succinato deshidrogenasa en las fracciones, superpone una línea de color rojo, que nos indica en qué fracciones se encuentran las mitocondrias
Colectamos las fracciones de nuestro interés
El programa nos muestra las fracciones elegidas
Ahora queremos ver las microscopía electrónica de una de las fracciones elegidas: 115. Podemos apreciar que sólo hay mitocondrias.
También podemos pedir estadillos de purificación
Resultados para succinato deshidrogenasa
O pedir estadillos para actividad de DNA
Resultados para actividad DNA
O pedir estadillo para actividad RNA
Resultados para actividad RNA
MALA PREPARACIÓN
Velocidad de giro de la centrífuga
Tiempo especificado
Aparecerá un panel de centrífuga que nos indica el proceso
Obtendremos finalmente un sobrenadante y un sedimento. Seleccionar un ensayo enzimático adecuado para determinar dónde se encuentra la fracción de interés
En nuestro caso, el marcador de mitocondrias es la succinato deshidrogenasa
El resultado que nos devuelve el programa nos indica que la mayor parte de las mitocondrias están en el sedimento. Más adelante colectaremos las fracciones que nos interesan, esto es, los sedimentos.
También podemos determinar la actividad de otros marcadores, como DNA
O determinar la actividad de RNA
Colectamos las fracciones con "pool fractions"
Y elegimos la fracción concreta
Para evaluar el aislamiento de nuestra fracción subcelular, dispondremos de MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Pudiendo observar que el resultado final no es demasiado bueno, puesto que se aprecian no sólo mitocondrias, si no también núcleos, retículo endoplásmico liso y rugoso, peroxisomas, membrana plasmática, etc.
Adicionalmente se podrá pedir en cada momento al programa un estadillo de cómo progresa nuestro aislamiento subcelular
Para cada uno de los marcadores que hayamos medido actividad (p.e. succinato DHasa)
El estadillo para la succinato deshidrogenasa será
La salida de los estadillos la haremos con "Continue" y nos iremos a "Go to next step" o a "Start again" y empezaremos de nuevo!!!
**** Apéndice ****
