Laboratorio Integrado I --> SIMULACIÓN 4 --> Generación del potencial de membrana.

INTRODUCCIÓN

En esta práctica se exploran diversas condiciones iónicas que producen una diferencia de potencial a través de una membrana, incluyendo aquéllas que generan potenciales de difusión, potenciales de Gibbs-Donnan o de estado estacionario mantenido por una bomba electrogénica.

El programa simula el movimiento real de los iones a través de la membrana, de acuerdo a la ley de Fick, de manera que cualquier desviación microscópica de la electroneutralidad es inmediatamente compensada, tal y como ocurriría en una situación real.

El programa detecta la aparición de diferencias de potencial a través de la membrana evaluando el potencial de Nernst de una especie iónica introducida en el sistema a modo de sonda, cuya concentración es suficientemente pequeña para no perturbarlo, y su permeabilidad suficientemente alta para suponer que, en todo momento, la sonda está en equilibrio. El potencial medido por la sonda equivale al potencial que se detectaría introduciendo en cada compartimiento electrodos conectados a un voltímetro. De esta forma el programa demuestra de una manera realista, análoga al empleo de sondas radiactivas en el laboratorio, e independiente de cualquier modelo termodinámico preestablecido, que una distribución iónica concreta es capaz de generar una diferencia de potencial a través de la membrana.

Se utilizará un programa sencillo de ejecución en MS-DOS. Este programa se ejecuta sobre la aplicación DOSbox. Debes descargar en tu disco duro y descomprimir el fichero DOSBOX.rar sobre el disco C:\ en una carpeta c:\dosbox\

En la figura siguiente puedes ver todos los ficheros y carpetas que se generan después de descomprimir DOSbox.

Para ejecutar DOSbox abre la carpeta DOSbox-0.73 y veras todos los ficheros que contiene, según se muestra en la siguiente figura.

Debes hacer doble click sobre el fichero dosbox.exe y se ejecutará la apertura de un entorno de MS-DOS en el que además está instalado un Windows 3.11. Debes moverte entre directorios con la sintáxis de comandos típica de MS-DOS.

El fichero ejecutable es "potmem.exe". La pantalla inicial de ejecución de este programa se puede ver en la siguiente figura.

OPCIONES DEL PROGRAMA

Al empezar el programa, aparece un menú de opciones. Teclee el número correspondiente a la opción que desee modificar y pulse retorno. El tiempo máximo de la escala corresponde al valor máximo del eje de las abscisas (tiempo) en la representación cinética, y permite visualizar los procesos en la escala de tiempos que se desee. El intervalo de tiempo por iteración corresponde al incremento de tiempo en el que el programa computa, cada vez, el movimiento de los iones [cuanto mayor es éste, tanto más rápido se ejecuta el programa, pero su valor superior está limitado por las fluctuaciones en la concentración de la sonda, que pueden hacerse caóticas y generar un error de rebosamiento (overflow); si ello ocurre, se hace necesario comenzar el programa de nuevo, asignando un intervalo de iteración más pequeño]. Beta es la velocidad de bombeo de la Na⁺/K⁺-ATPasa, en unidades arbitrarias: asígnele un valor de 0 si no va a simular su efecto. Número de cambios en beta es el número de veces que se va a modificar dicho parámetro a lo largo de la cinética; si dicho valor es distinto de cero, aparecen nuevas opciones en las que se pueden introducir los cambios de beta y los tiempos (absolutos) en los que entrarán en vigor dichos cambios.

Los extremos de la escala de concentraciones y voltajes son los valores máximo y mínimo de los ejes de las ordenadas de las representaciones de concentraciones y voltajes respecto al tiempo. Sirven para visualizar las variaciones a la escala que se desee.

El número total de especies iónicas presentes incluye la pareja de iones formada por la sonda que detecta el potencial. El programa considera que la sonda está formada por las especies 1 y 2. Por ello este lugar en la tabla de especies iónicas debe de reservarse exclusivamente para la sonda. En el resto de la tabla pueden consignarse la concentración, carga y permeabilidad (en unidades arbitrarias) de las restantes especies iónicas de manera que los cationes deben de ocupar las líneas impares y los aniones las pares. No introducir concentraciones superiores a 150. No tienen sentido físico las distribuciones en las que las sumas de cargas positivas no sea igual a las negativas.

PRESENTACIÓN DE LA CINÉTICA

La gráfica superior representa las concentraciones en el compartimento interior de todas las especies iónicas, exceptuando las de la sonda, frente al tiempo. Las concentraciones iónicas en ambos compartimentos incluyendo las de la sonda se muestran en la tabla de la derecha así como de forma gráfica por la barra inferior del número para facilitar la interpretación de las variaciones. La gráfica inferior representa la variación del potencial de Nernst de la sonda (línea contínua) y del potencial dado por la ecuación de GHK (líneas de puntos), modificada para tener en cuenta el efecto de las bombas electrogénicas (y que no puede aplicarse si beta=0). Dichos potenciales también se muestran en la línea intermedia en mV.

El efecto de la Na⁺/K⁺-ATPasa se simula intercambiando tres iones de Na⁺ (de dentro hacia fuera) y de dos de K⁺ (de fuera hacia dentro), a una velocidad constante, controlada, en unidades arbitrarias por el parámetro beta (la velocidad de recambio es proporcional a beta), de forma que los datos correspondientes al ión sódio deben de ser los de la especie 3 y los del potasio los de la especie 5 para que el programa haga funcionar correctamente a la ATPasa.

REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA

Estudio de los potenciales de difusión. Compruebe que la velocidad con que dos especies iónicas situadas en un compartimento difunden hacia el otro depende de su permeabilidad. Para ello utilice la distribución iónica de partida que consiste en dos especies iónicas con la misma permeabilidad y observe como difunden. Repita la experiencia introduciendo una permeabilidad mayor e idéntica para cada una de las especies. Compruebe que las especies difunden ahora más rápido. Asigne ahora una permeabilidad a una de las especies iónicas mayor que a la otra. Compruebe que aparece un potencial de difusión. Observe como es transitorio y desaparece en el equilibrio.

Sugerencias avanzadas:

1. Compare el potencial de la sonda con el potencial dado por la ecuación de GHK mediante una calculadora.
2. Interrumpa la cinética en un momento dado (tecla 0). Calcule el potencial de difusión generado considerando la concentración de iones existente en ese momento (el coeficiente de partición es el mismo para todas las especies ionicas). Compruebe que después de cierto tiempo el potencial de difusión teórico se aproxima al de la sonda.
3. Idee alguna otra distribución de iones que podría generar un potencial de difusión. Compruebe que éste, en efecto, se genera utilizando el programa.

Estudio de los potenciales de Gibbs-Donnan. Compruebe que en una distribución de este tipo aparece un potencial de membrana de equilibrio sólo si una de las especies es indifusible. Calcule la concentración teórica de las especies iónicas en el equilibrio. Compruebe que el resultado coincide con la simulación del ordenador. Idem con el potencial de membrana.

Sugerencia avanzadas:

1. ¿Coincide el potencial medido por la sonda con el calculado a partir de la eq. GHK?
2. ¿Existe un potencial a tiempo cero?
3. Asigne una permeabilidad de 0.1 en vez de 0 al ión impermeable. Interprete lo que ocurre ahora (esta situación, más realista, se llama pseudo Donnan). ¿Aparece un potencial o no? ¿Es permanente el potencial?

Estudio de los potenciales en el estado estacionario. Compruebe que una distribución fisiológica de iones genera un potencial cercano a -70 mV. Para ello, recupere la distribución iónica del fichero AXON1.TXT (con la opción 201). Eche un vistazo a las concentraciones y permeabilidades de las diferentes especies (N= Na, C= Cl, K= K y X representa un anión indifusible) y compruebe que dicha distribución iónica, así como las permeabilidades respectivas son semejantes a las fisiológicas. Compruebe que aparece un potencial de membrana que se va disipando poco a poco a medida que los iones fluyen a favor de su gradiente de concentración. Asigne ahora a beta un valor de 1.03. Compruebe que ahora el potencial de membrana permanece estable y que el potencial de la sonda coincide con el de la eq. GHK modificada para tener en cuenta bombas electrogénicas.

Recupere ahora el fichero AXON2.TXT. Se obtiene una distribución idéntica a la anterior, pero la ATPasa deja de funcionar a los 1.4 ms y comienza a funcionar de nuevo a los 3 ms. Interprete el resultado.

Sugerencia avanzadas:

1. Calcule el potencial de acuerdo a la eq. GHK, modificada para el efecto de la Na⁺/K⁺-ATPasa. Compruebe que coincide con el potencial de Nernst de la sonda y el potencial calculado por el ordenador.
2. Compruebe, con el fichero AXON2.TXT, que el ión cloruro no es afectado por la Na⁺/K⁺-ATPasa; observe, no obstante, cómo la bomba afecta indirectamente a su concentración, forzándola a volver al valor inicial.
3. Asigne a beta un valor inicial ligeramente más alto. Idem más bajo. ¿Qué ocurre con el potencial de membrana?.
4. Pruebe el efecto de cambiar la permeabilidad basal del sodio, del cloruro o del potasio.