Laboratorio Integrado I --> SIMULACIÓN 6 --> Análisis de corrientes eléctricas macroscópicas de canales iónicos activados por voltaje.

INTRODUCCIÓN

Los canales iónicos dependientes de voltaje son los responsables de la generación de los potenciales de acción en el sistema nervioso. Los canales iónicos pueden encontrarse en dos estados, uno cerrado (no conductor) que no permite el paso de iones y, otro abierto (conductor) que permite el paso de iones en función de su gradiente electroquímico (de mayor a menor). A nivel molecular, la transición desde el estado cerrado al estado abierto es un cambio conformacional de la proteína inducido por la energía liberada de la unión de un ligando, o por la aportada por un cambio en el voltaje a través de la membrana plasmática. A los primeros se les conoce como canales iónicos activados por ligando y, a los segundos, canales iónicos activados por voltaje. Independientemente del estímulo o señal que activa estas moléculas, una vez en el estado abierto permiten el paso de iones (permeación) y, dependiendo del grado de selectividad, pueden subclasificarse como selectivos a cationes o a aniones. La selectividad iónica puede ser tal que se permita preferente el paso de un ión en particular como el Na⁺ (canales de sodio), el K⁺ (canales de potasio) o el Ca²⁺ (canales de calcio).

Biofísicamente, la actividad macroscópica de un canal se caracteriza por una serie de parámetros que incluyen su dependencia del estímulo (ligando o voltaje), cinética de apertura y cierre, selectividad iónica, y desensibilización a la presencia prolongada del estímulo. Adviértase que la definición macroscópica se refiere a las propiedades obtenidas de medir simultáneamente el comportamiento o respuesta de una población de canales a un estímulo activador.

En esta práctica vamos a familiarizarnos con estos conceptos, para ello aprenderemos a obtener las propiedades biofísicas de un canal modelo activado por cambios en el voltaje de la membrana. La práctica contempla el uso del paquete de software pClamp6.0 y, en concreto, de su programa Clampfit. Además, los datos también se procesarán en el programa de análisis Origin. Los ejemplos que utilizaremos serán un canal de potasio y un canal de sodio.

El paquete de software pClamp6.0 se ejecuta en un entorno de MS-DOS y no funciona bien en sistemas operativos Windows XP SP2, SP3; Vista o Windows 7, por lo que recurrimos a ejecutarlo sobre un simulador de MS-DOS: dosbox. Debes descargar en tu disco duro y descomprimir el fichero DOSBOX.rar sobre el disco C:\ en una carpeta c:\dosbox\

En la figura siguiente puedes ver todos los ficheros y carpetas que se generan después de descomprimir DOSbox.

Para ejecutar DOSbox abre la carpeta DOSbox-0.73 y veras todos los ficheros que contiene, según se muestra en la siguiente figura.

Debes hacer doble click sobre el fichero dosbox.exe y se ejecutará la apertura de un entorno de MS-DOS en el que además está instalado un Windows 3.11. Debes moverte entre directorios con la sintáxis de comandos típica de MS-DOS. Como ves en la figura siguiente este programa dispone de diferentes ficheros ejecutables de nuestro interés, entre otros "CLAMPFIT.exe", "FETCHAN.exe" o "PSTAT.exe".

Si ejecutamos "CLAMPFIT.exe" la pantalla inicial de este programa se puede ver en la siguiente figura.

Después de 2-3 segundos aparece automáticamente la siguiente pantalla que ya nos permite trabajar con el programa:

NOTA IMPORTANTE

Estas prácticas se realizarán de forma individual y los informes que se elaborarán serán también individuales. Dado el carácter autoformativo de estas prácticas, el profesor encargado no estará presente durante su realización. El profesor encargado resolverá cuantas dudas surjan en sesiones de tutoría que se organizarán semanalmente; asimismo contestará a las cuestiones que se le propongan por correo electrónico.

OBJETIVOS

• Aprender a manejar del programa Clampfit.
• Identificar una corriente eléctrica macroscópica.
• Obtener relaciones corriente-voltaje (I-V) con el programa Clampfit.
• Obtener los parámetros cinéticos del proceso de inactivación.
• Obtener la selectividad iónica de un canal modelo. Potenciales de inversión.
• Importación archivos ASCII de datos I-V.
• Transformación de la I-V en G-V.
• Obtener los parámetros dependientes de voltaje: V_0.5 y a_n.
• Estimar z_g a partir de la G-V.

Los archivos a analizar son: SHAKRC01, SODIUCO1, D6902C01, D6902C02, y D6902C03.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Programa clampfit y obtención de la relación I-V.

Clampfit es un subprograma del paquete de software pClamp6.0 que permite la lectura, análisis y exportación de corrientes iónicas macroscópicas. Para ejecutar el programa hay que seleccionar el icono correspondiente en la carpeta pClamp6.0 y la función ejecutar (o un doble clic en el icono). Una vez cargado el programa se observará que el menú aparece en la parte inferior de la pantalla, con la primera letra de cada opción en azul. En este caso los cursores no nos servirán para movernos por el menú. La forma de hacerlo es presionando la letra en azul. Por ejemplo, para cargar un archivo tendremos que ir al submenú de "File", para ello presionaremos la letra "F", y observaremos la aparición de un nuevo menú de opciones, entre las que figura "Opendata". Siempre se puede volver al menú anterior presionando la tecla "Escape". Una vez en Opendata, nos aparecerá las opciones para seleccionar un archivo:1) tipo de archivo o extensión del archivo: *.DAT (en nuestro caso); 2) Directorio donde está el archivo (C:\PCLAMP6\PCL6DATA); y, 3) el nombre archivo de datos a analizar.

Seleccionado el archivo de datos, el programa automáticamente nos mostrará el tipo de datos que contiene. Seguidamente, seleccionando la opción "Display" modificaremos la escala de los ejes para amplificar, si cabe, las trazas iónicas presentadas. Realizado este ajuste, nos enfocaremos a obtener la curva I-V, para ello, en primer lugar situaremos uno de los cursores (barras verticales en pantalla) en el máximo de la corriente e iremos al submenú "X-Y". En este submenu seleccionaremos los valores de X e Y correctos para obtener la corriente I-V. El valor correcto para la X es, en la opción Data, el valor de la "waveform B" (los valores de los voltajes aplicados para estimular al canal iónico). El valor correcto para el eje de ordenadas es aquel reflejado por la posición del cursor 1. Terminado el proceso, se realizara el "update" y si todo se hizo correctamente, aparecerá la I-V característica de las corrientes guardadas en el archivo de datos. La gráfica que aparece, junto con las trazas de las corrientes iónicas, seguidamente se imprimirán utilizando la opción "export" seguida de "plot". Además, a fin de obtener la curva de conductancia macroscópica del canal, la relación I-V se exportará como archivo ASCII para ser posteriormente analizado con el programa Origin. Este procedimiento lo realizaremos en tres canales modelo: un canal de potasio no inactivante (D6902C01), un canal de potasio que se inactiva (SHAKRC01) y un canal de sodio (SODIUCO1). La presentación de los resultados puede hacerse más elegante con el programa Origin.

Cinética de la etapa de inactivación.

El siguiente objetivo será el ajuste de la cinética de la corriente de inactivación del canal de potasio inactivante y del canal de sodio. Para esta tarea, en el archivo original de los datos, en primer lugar, delimitaremos con los cursores la zona de las trazas a ajustar (en nuestro caso, desde el pico de la corriente hasta su descenso a línea base). Seguidamente, iremos a la opción "Fit", seleccionaremos una función exponencial, un método de ajuste y ejecutaremos la función ("enter"). Observaremos los resultados como funciones trazadas sobre los datos. La matriz de resultados se puede visualizar en "Results". Con el fin de determinar el número mínimo de funciones exponenciales que describen el proceso, el ajuste se realizará a una, dos, tres y cuatro exponenciales, anotando siempre en el cuaderno los resultados de cada ajuste para así poder comparar al final las constantes de tiempo, amplitudes y parámetros estadísticos. El análisis de los parámetros estadísticos del ajuste (suma de mínimos cuadrados, c ²) nos informará de cual es el número de procesos exponenciales que mejor define las corrientes iónicas. En el supuesto (muy probable) de que todas las corrientes contenidas en el archivo de datos no pudiesen ajustarse simultáneamente por desalineamiento o desplazamiento de los máximos de corriente (fácilmente observable cuando se posiciona el cursor delimitante del ajuste), se realizará el ajuste individual de las trazas. Para ello, las corrientes individuales se seleccionaran haciendo uso de la opción "Selectrace". El procedimiento de ajuste es idéntico al descrito en la sección 1.

Determinación de los potenciales de inversión: medida de la selectividad iónica.

El potencial de equilibrio se define como aquel valor del potencial de membrana para el que no fluye corriente eléctrica. A este potencial no hay flujo de iones a través del canal pues los gradientes electroquímicos a ambos lados de la membrana son iguales. Este potencial también se llama de inversión pues es el valor al cual se puede invertir el sentido de la corriente eléctrica. Para entender este aspecto, recordemos que la ley de Ohm para un circuito con fuerza electromotriz, V_eq (por ejemplo, una pila) nos dice que:

Para I= 0, entonces V=Veq. En canales iones se utiliza el termino conductancia del canal (G) que equivale a la inversa de la resistencias (1/R):

Nótese que: Sí I < 0, entonces V<V_eq

Sí I > 0, entonces V>V_eq

De este modo, a V_eq también se le conoce como el potencial de inversión (V_r). Para voltajes menores que el Veq (o Vr) la corriente observada será negativa, mientras que para voltajes mayores que el Veq (o Vr) será positiva. ¿Cómo se relaciona el voltaje de equilibrio de un ion a través de la membrana con la concentración? Para responder a esta pregunta debemos de recordar la ecuación de Nernst cuya formulación es:

Donde [X]_o es la concentración extracelular del ión X y, [X]_I es su concentración intracelular. 25.26 mV es el valor de la relación RT/F a 20^oC. Para los iones K⁺, cuya concentración intracelular es ~150 mM y extracelular ~4 mM, el V_eq=-91 mV. Para el Na⁺ sería +67 mV ¿Por qué? ¿cuál sería el del Ca²⁺ y Cl^-?. Es importante señalar que la convención utilizada para medir el potencial de membrana es de negativo con respecto al interior. Así, la despolarización de la membrana significa que el potencial de membrana se hace mas positivo en el interior (intracelularmente), mientras que la hiperpolarización indica que el potencial de membrana se hace más negativo en el interior celular. La ecuación (3) nos informa que podemos modificar el V_eq cambiando la relación [X]_o/[X]_i. Este es precisamente el protocolo que se utiliza experimentalmente para determinar la selectividad iónica de un canal, en otras palabras, se monitorizan los cambios en V_eq o V_r cómo consecuencia de cambios en la composición iónica extracelular o intracelular.

En esta parte de la práctica determinaremos la selectividad de un canal de potasio no inactivamente. Para realizar esta tarea, se midieron las corrientes iónicas macroscópicas a dos concentraciones de [K⁺]_o (3 y 30 mM). Como la configuración utilizada fue de célula entera ("whole cell"), la concentración intracelular de K⁺ permaneció constante (~140 mM). Experimentalmente se miden las corrientes de "cola" que corresponden a las corrientes iónicas remanentes tras la eliminación repentina del pulso de voltaje despolarizante. En otras palabras, las corrientes de cola sirven para medir la cinética del proceso de cierre del canal (también conocido como "desactivación"). Para entender este protocolo experimental, volvamos momentáneamente a la ecuación (2):

Si aplicamos un pulso despolarizante a un voltaje en que todos los canales estén abiertos, y repolarizamos a distintos voltajes, entonces tenemos que G=cte, y la magnitud y signo de I dependerá exclusivamente de la diferencia V-V_eq. De aquí, cuando V=V_eq, entonces I=0, y este será el valor del potencial de inversión. Este valor depende de las concentraciones iónicas del ión permeante. Estos valores experimentales se comparan con los valores teóricos calculados con la ecuación (3). Evidentemente, cuanto más próximos sean los valores experimentales a los teóricos, mayor será la selectividad al ión estudiado, en nuestro caso K⁺. Téngase en cuenta que si el cambio en la concentración de un ión no produce cambios en V_eq, ello nos indica que este ión no permea a través del canal iónico.

Al igual que en los casos anteriores, se seleccionaran los archivos de datos (D6902C02 y D6902C03), y se medirán las corrientes I-V de las corrientes de "cola", que son aquellas que aparecen después del pulso despolarizante. Este proceso se realizara para los archivos de datos obtenidos a las dos [K⁺]_o. Obtenidos las I-V, se realizara una interpolación para determinar el potencial al que I=0. Seguidamente, se calcularan los valores teóricos utilizando la ecuación de Nernst (3), y se compararan con los valores experimentales.

Determinación de las propiedades voltaje dependientes de los canales.

En la última parte de la práctica nos ocuparemos de determinar las propiedades de voltaje dependencia de los canales ejemplo estudiados, es decir, el de K⁺ y el de Na⁺. Como se dijo anteriormente, estos canales responden a las variaciones del voltaje transmembrana mediante cambios conformacionales que conducen a la transición del estado cerrado al abierto, permitiendo así el paso iones. Cada canal va a requerir una cantidad de energía característica para realizar la transición cerrado-abierto, así como va a mostrar una eficacia sufriendo dicho cambio. Estas dos propiedades son fácilmente mensurables y ayudan a caracterizar y clasificar a los canales iónicos dependientes de voltaje. Por tanto, el objetivo de esta parte será familiarizarnos con estos parámetros y aprender como se determinan a partir de una relación I-V.

En principio, el procedimiento es bastante sencillo, pues consiste en obtener la relación I-V como se explicó anteriormente, seguida de su transformación para obtener la G-V (conductancia voltaje) y, finalmente, el ajuste de esta ultima a una distribución de Boltzman. Pero, vayamos por partes. La obtención de la I-V no necesita de mas comentarios ni explicaciones. Una vez conseguida, se exportaran ("Export") los resultados como un fichero ACSII (extensión *xys). La transformación de los datos la realizaremos en el programa Origin4.1 (también puede hacerse fácilmente en Excel). Para ello, ejecutaremos el programa y en el submenu "File" seleccionaremos "Import" y "ASCII". Buscaremos el directorio/subdirectorio donde guardamos nuestro(s) archivo(s) y lo(s) cargaremo(s). El programa nos pedirá que definamos que columna será el eje de abcisas "X", y cual el de ordenadas "Y". Incorporada esta información, obtendremos la representación gráfica de los datos de I-V, que será idéntica a la obtenida con el programa Clampfit. La etapa siguiente consiste en la transformación de los valores de corriente I a valores de conductancia G. ¿Por qué? Si se analiza la ecuación (4) puede observarse que la corriente iónica crece linealmente con el aumento del voltaje (o fuerza motriz) aplicado y con la conductancia de los canales G (también conocida como probabilidad de apertura). A voltajes bajos, la corriente total está definida principalmente por el número de canales que se abren (G_v). Una vez abiertos todos los canales (G_max) la corriente iónica sigue aumentando debido a la energía aplicada (conocida como la "driving force" o fuerza electromotriz). Para determinar las propiedades voltaje dependientes necesitamos relacionar la conductancia o probabilidad de apertura G con el voltaje aplicado. Por tanto, se requiere eliminar el factor energético que contribuye a I. Así, para determinar G, reescribimos:

En el programa Origin, seleccionar la opción "Simple Math", en Y1 escoger la columna de las Y, como operador la división, "/", y como Y2 poner X-(V_eq) para el canal de potasio y para el canal de sodio. Automáticamente se realizara la transformación y la curva I-V se convertirá en G-V. La mayor diferencia a observar es que la curva G-V es de tipo sigmoidal, mostrando saturación o convergencia hacia un valor G_max (probablemente se necesite reajustar la escala del eje de ordenadas para mostrar con claridad la curva!!). Esta curva puede describirse con una distribución de Boltzman, que indica la probabilidad de encontrar el canal en un estado particular (abierto y/o cerrado) cuando el voltaje aplicado es V:

Donde G_max es la conductancia máxima, es decir, la conductancia cuando todos los canales están abiertos (probabilidad=1); V_0.5, el voltaje al que G=G_max/2; y, a_n representa la pendiente de la curva, una medida de la eficacia (o cooperatividad) del proceso de apertura del canal. Obviamente estos son los parámetros a calcular. Para ello, en el programa Origin4.1 se selecciona la opción "Analysis" y, dentro de ella, la opción "Non-linear curve fit". En la ventana que aparece, se selecciona la curva a ajustar (Boltzman), y en "action" se seleccióna "fit". Se ejecuta la subrutina de ajuste hasta alcanzar los valores mínimos bien en la suma de los cuadrados o en el valor de c ². Los valores del ajuste se anotan en el cuaderno y a partir de ellos se obtienen los parámetros descritos anteriormente.

Además de los valores de G_max, V_0.5, y a_n, de la curva G-V también pueden estimarse el número de cargas que se mueven durante el proceso de apertura del canal iónico. A este valor se le llama valencia de apertura ("gating valence", z_g). Para obtener z_g, se analiza el "pie" de la curva, es decir, los valores de G-V en el rango de G/G_max£ 0.2 (~20% de probabilidad de apertura). La razón de medir en este rango es que a estos valores se minimiza la contribución de fenómenos de cooperatividad entre subunidades al proceso de apertura, y la corriente detectada es, en su mayor parte, debido al desplazamiento de cargas en el seno de la proteína. Nótese que cuanto menor sea el valor de G/G_max escogido, mayor será la exactitud del valor de z_g obtenido. Desafortunadamente, la resolución experimental impone un límite de sensibilidad difícilmente superable. Por ello, el valor que se estime de z_g será siempre un infraestimado del número de cargas que se mueven durante la apertura. La estrategia experimental para obtener el número de cargas en movimiento es anular la corriente iónica y medir directamente las corrientes de gatillo (gating currents), que son corrientes diminutas resultantes del movimiento de residuos cargados en el seno de la proteína, en concreto, en el dominio que siente el cambio de voltaje transmembrana, el sensor de voltaje. En cualquier caso, conocer el valor de z_g resulta importante para caracterizar con precisión las propiedades biofísicas de los canales iónicos. Este será precisamente nuestro objetivo último.

Para determinar z_g se transforma logarítmicamente la ecuación (7), y se obtiene el límite cuando p (o G) se aproxima a cero (p® 0), G_o:

En la curva G-V, normalizar el eje de ordenadas con respecto a G_max y, transformarlo logarítmicamente (seleccionar "Format", "Axes", "Y-axes" y "type"). Reajustar escala del eje, delimitar la zona de ajuste lineal desde 0.0 £ G/G_max, £ 0.1. Ajustar linealmente y determinar z_g utilizando la ecuación (8).

Obsérvese que z_g puede obtenerse fácilmente de la pendiente de la recta.

PREGUNTAS

1. ¿Qué información se obtiene de una curva corriente-voltaje?
2. ¿Qué utilidad tienen los potenciales de inversión?
3. ¿Cómo se estudia la dependencia de voltaje de un canal iónico?
4. ¿Qué significado tiene la valencia de gating?