Laboratorio Integrado I --> SIMULACIÓN 7 --> Análisis de corrientes eléctricas de canal único dependiente de voltaje.

INTRODUCCIÓN

Habiendo visto las características y propiedades de las corrientes macroscópicas, el siguiente objetivo de la práctica será el análisis de corrientes unitarias. Por corriente unitaria entendemos la corriente que fluye a través de un único canal. Obsérvese que las corrientes macroscópicas resultan de la sumación de las corrientes iónicas que fluyen a través de una población de canales.

Nuestro conocimiento acerca del comportamiento de los canales iónicos procede fundamentalmente del desarrollo de la técnica del pinzamiento zonal de membrana o patch clamp. Esta técnica permite registrar corrientes iónicas unitarias a través de zonas minúsculas de membranas celulares. Los registros de canal unitario son de naturaleza aleatoria. La apertura del canal se refleja en aumentos o disminuciones repentinas en intensidad de corriente registrada, según el sentido de la corriente iónica. Los pulsos que aparecen en un registro de canal unitario son cuadrados y corresponden a las transiciones finitas entre los estados cerrado (no conductor) y abierto (conductor) del canal. El análisis de los fenómenos unitarios es de naturaleza estadística. La altura del pulso corresponde a la intensidad de corriente que atraviesa un único canal. Si en el registro hay dos canales activos se observan pulsos de intensidad unitaria y doble. Estos últimos corresponden a la apertura simultanea de los dos canales.

OBJETIVOS

1. Aprender el manejo del programa Fetchan y pSTAT.
2. dentificar una corriente eléctrica unitaria: estados cerrado y abierto.
3. Obtener manualmente la conductancia unitaria de un canal.
4. Obtener el Histograma de Amplitudes.
5. Ajustar el histograma a distribuciones de Gauss.
6. Obtener la conductancia y probabilidad de los estados cerrado y abierto.
7. Construir las tablas de eventos para el estado cerrado y abierto.
8. Obtener el histograma de tiempo de residencia.
9. Obtener el número de estados cinéticos y sus constantes de tiempo.

Los archivos a analizar son: KCHANN, DEMOFTX y 4LEVEL

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Cálculo de la conductancia unitaria: Histograma de distribución de estados.

La medida de la corriente iónica que fluye por un canal es fácilmente calculable en un registro de canal unitario, basta con medir la diferencia de amplitud entre el estado cerrado (línea base) y el estado abierto. Conociendo los detalles de como se realizó y adquirió digitalmente el registro, se puede calcular fácilmente la equivalencia entre unidades de medida (mm o cm) y unidades de corriente unitaria (pA, pico-amperios). Este procedimiento debe realizarse en una población estadísticamente significativa de aperturas y cierres para obtener un valor preciso de la corriente unitaria que fluye a través del canal a un determinado voltaje. Conociendo la corriente unitaria (i) y el voltaje impuesto (V), la conductancia unitaria, g, se calcula fácilmente utilizando la ley de Ohm:

Las unidades de g son en pS (pico-siemens). Nótese que un valor mucho más preciso de g se obtiene si se analiza la curva i-V (para canal unitario), pues la pendiente de la misma corresponde al valor de la conductancia.

Hemos descrito el caso ideal en que los estados cerrado y abierto están claramente definidos y el nivel de ruido es relativamente bajo. La realidad, sin embargo, nos muestra muchas veces que el ruido es un factor importante que puede enmascarar el verdadero estado abierto. La presencia de más de un canal en el registro también puede llevar a confusión. Un método alternativo para obtener g es construir un histograma de amplitudes o histograma de distribución de estados. La forma de hacerlo es muy sencilla: se mide la intensidad de corriente de cada punto del registro de canal unitario y se agrupan las medidas en intervalos de amplitud determinada (p.e. 0.08 pA). Realizada la agrupación, se grafica el histograma de frecuencias (número de casos vs. corriente iónica). Se observará que aparece una distribución en forma de campana (o distribución gaussiana) con uno o más picos: Si el registro tiene dos estados, el histograma mostrará dos picos claramente definidos. Conseguido el histograma de amplitudes, los valores experimentales pueden ajustarse a distribuciones de Gauss para determinar los parámetros que las caracterizan: media (m ), anchura (w) y área bajo la curva (A):

Los valores de la media, m , representan los estados definidos de canal, cerrado y abierto(s) (¿Qué representa w?). En otras palabras, nos indican la corriente iónica que fluye por el sistema y, por tanto, a partir de ellos puede calcularse la corriente que pasa por un único canal. Idealmente, el estado cerrado estará centrado en el valor cero de corriente, m =0, sin embargo, en la realidad la línea base suele mostrar una corriente residual. Por tanto, la corriente iónica que pasa por el canal será la diferencia entre la corriente residual del estado cerrado y la que fluye por el estado abierto, en otras palabras, la diferencia entre las medias de las campanas de Gauss: m _o-m _{i1, m o}-m _i2,…… m _o-m _n.

Cálculo de la probabilidad de apertura y cierre.

El histograma de amplitudes nos aporta información adicional del comportamiento del canal. Específicamente, nos informa sobre la probabilidad de encontrar al canal en el estado cerrado o cualquiera de los estados abiertos. Nótese que para construir el histograma puntual se contaron las veces que el canal se movía de un estado a otro y, como se analizaron todos los puntos del registro, se obtuvo además información acerca del tiempo en que el canal residía en un estado u otro. Esta valiosa información queda reflejada en el área de las distribuciones de Gauss que componen el histograma de amplitudes. Claramente, cuanto mayor sea el área de una distribución mayor será el tiempo de residencia del canal en ese estado particular y mayor será la probabilidad de encontrarle en ese estado. Por tanto, la probabilidad de canal abierto se puede calcular fácilmente mediante:

Donde A_x representa el área bajo la curva de Gauss del estado x (cerrado o abierto). La probabilidad del estado cerrado puede calcularse fácilmente siguiendo la misma estrategia.

Obtención de la tabla de eventos de los estados cerrado y abierto.

La etapa siguiente de la práctica consistirá en estudiar la cinética del comportamiento de canal unitario, es decir, en extraer información sobre el comportamiento aleatorio de las transiciones apertura-cierre. El estudio de estos fenómenos nos permite proponer modelos cinéticos para comprender las etapas cinéticas que sigue la proteína en respuesta al estímulo que provoca el cambio conformacional al estado abierto. Asimismo, nos informa de la estabilidad relativa de los distintos estados en que puede encontrarse la proteína.

Nos centraremos, pues, en estudiar la cinética de apertura-cierre de registros de canal unitario sencillos, caracterizados por dos estados, cerrado y abierto. El primer paso en este tipo de estudio es obtener la tabla de eventos de los dos estados, como se indica seguidamente:

1. En el registro de canal unitario se identifican los estados.
2. Se mide la duración temporal de cada una de las transiciones o eventos.
3. Se separan las medidas del estado cerrado y abierto en tablas.

Obtendremos así dos tablas, una para el estado cerrado y otra para el estado abierto, en la que estarán listados los tiempos que el canal ha residido en cada uno de ellos. Estas son las tablas de eventos. Comprobareis que la construcción manual de estas tablas es tediosa y lenta (aunque necesaria para entender como lo hace el programa de ordenador). Con el ordenador, el proceso es similar, primero se le dicen a la maquina cuales son los estados cerrado y abierto. Posteriormente, se ejecuta la subrutina que identifica las transiciones (las cataloga como cerrado o abierto, ¿Cómo?), mide su duración temporal y, automáticamente, construye las tablas de eventos.

Histogramas de tiempo de residencia de los estados cerrado y abierto.

¿Para que sirven las tablas de eventos? Pues muy sencillo, para obtener los histogramas de tiempo de residencia (Dwell Time Histograms) de los estados cerrado y abierto. La forma de construir estos histogramas es similar a la descrita para el de amplitudes. Los eventos temporales se agruparan en intervalos de una determinada amplitud (0.1 ms ó 0.3 ms ó etc). Entonces se representara la frecuencia de los distintos intervalos de tiempo en función de los tiempos de apertura o cierre, creándose así los histogramas. Estos histogramas, a diferencia de los de amplitudes, son descritos por funciones exponenciales del tipo:

Donde a y b son constantes y representan las áreas de los respectivos componentes exponenciales, t ₁ y t ₂ son las constantes de tiempo. El número de exponenciales que definen el histograma esta relacionado con el número de componentes que caracterizan a un estado en particular. Por ejemplo, si la cinética del estado cerrado se describe bien con dos exponenciales nos estaría indicando que el canal tiene que pasar por, al menos, dos estados cerrados antes de alcanzar el estado abierto. Nótese, pues, que este tipo de análisis puede utilizarse para sacar información valiosa sobre el mecanismo de apertura-cierre.

Utilización del ordenador para análisis de registros de canal unitario.

Se utilizaran los programas FETCHAN para análisis de los registros, y pSTAT para ajustar los histogramas que se obtengan. El funcionamiento de estos programas es similar al explicado para ClampFit. En primer lugar se cargaran los ficheros de datos y luego se procederá a realizar el tipo de análisis que se elija: Browse, para visualizar el registro; All pts-histograms, para obtener el histograma de amplitudes y, Events list, para obtener la tabla de eventos. Cuando se elijan estas dos ultimas alternativas, el programa nos pedirá al finalizar el análisis un nombre de archivo para guardar los resultados, y poder así analizarlos con el programa pSTAT. Con el pSTAT se procederá de la misma forma: seleccionar tipo de archivo, cargar el archivo de datos a analizar, proceder a su análisis.

Alternativamente, en FETCHAN, se pueden grabar los resultados obtenidos en un archivo ASCII para su análisis en programas como Origin. Es siempre recomendable realizar el análisis con dos programas distintos para ver que los resultados coinciden.

PREGUNTAS

1. ¿Qué significado tiene la conductancia unitaria? ¿Es saturable con la concentración de iones permeables?
2. ¿Qué te dice una distribución de amplitudes con varios picos?
3. ¿Qué es la probabilidad de apertura y de que depende?
4. ¿Qué información te suministran los tiempos de residencia?

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Al finalizar las prácticas se elaborará un informe de su desarrollo en el que se incluirán las gráficas obtenidas con los valores de los distintos parámetros discutidos. Es aconsejable usar los conocimientos de informática aprendidos y realizar un informe con gráficas y texto en ordenador, cuidando la presentación. Se pueden utilizar los programas informáticos que resulten más familiares: Word, Excel, Canvas, Origin etc. Las prácticas se realizarán individualmente y los informes serán individuales. Incluir la respuesta a las preguntas planteadas a lo largo y final de la práctica.