TÉCNICAS INSTRUMENTALES BÁSICAS

Práctica 3: técnicas de centrifugación.

Introducción

La sedimentación de material particulado como consecuencia de la aplicación de campos centrífugos diversos, constituye una alternativa técnica de interés para el fraccionamiento o la obtención de materiales biológicos que incluyen células u orgánulos subcelulares, así como para la determinación analítica de parámetros hidrodinámicos de diversas macromoléculas.

Contenidos

En esta práctica/demostración nos centraremos en los aspectos más preparativos de las llamadas técnicas de centrifugación y de modo especial en el fraccionamiento subcelular. A tal efecto, se examinarán en primer lugar varios tipos de homogeneizadores, instrumentos destinados a disgregar las células presentes en los diversos tejidos y a romperlas de forma controlada y lo más reproducible posible para conseguir la liberación de los orgánulos subcelulares, con la mínima alteración morfológica y funcional de estos. Dada la distinta consistencia de los tejidos animales o vegetales, así como la existencia o no de paredes o cubiertas protectoras en los distintos tipos celulares procariotas o eucariotas, es obvio que deberemos recurrir a procedimientos de homogeneización más o menos drásticos para conseguir el fin deseado. A lo largo de la práctica examinaremos dos tipos de homogeneizadores (Potter-Elvehjem y Polytron) en los que la rotura celular viene causada por fuerzas de cizalladura (rozamiento) en medio líquido.

También se comentarán las características de otro tipo de homogeneizador, la llamada bomba de nitrógeno, que está basada en un fenómeno de cavitación gaseosa.

El componente central de la actividad consistirá en analizar las características y componentes principales de una ultracentrífuga preparativa Beckman modelo L8-70. Junto a la ultracentrífuga se examinarán varios de los distintos rotores que pueden utilizarse en la misma. Las figuras que se adjuntan muestran ejemplos representativos de los principales tipos de rotores existentes: de ángulo fijo, basculantes, verticales o casi verticales. La Tabla adjunta recoge asimismo las características de mayor interés de algunos de estos rotores. Por último, se incluye un nomograma que permite relacionar la velocidad de giro del rotor, con la fuerza centrifuga resultante para una distancia radial determinada.

CARACTERISTICAS DE ROTORES DE ULTRACENTRIFUGA

NOMOGRAM: ALIGN A STRAIGHTEDGE THROUGH KNOWN VALUES IN TWO COLUMNS; READ THE FIGURE WHERE THE STRAIGHTEDGE INTERSECTS THE THIRD COLUMN.

Bibliografía

Junto a los textos generales recomendados para toda la asignatura, se recomiendan:
- Centrifugation in Biology and Medical Science. Philip Sheeler, Wiley Interscience (1981).
- Introduction to Analitical Centrifugation, Volume I. Greg Ralston, Beckman (1993).

Simulación de un proceso de fraccionamiento subcelular

La práctica de fraccionamiento subcelular consiste en el aislamiento de una fracción problema (mitocondrias, núcleos, cloroplastos, retículo endoplásmico, peroxisomas, lisosomas, etc.) a partir de distintos materiales (hígado de rata, cultivos de tejidos celulares y hoja de espinaca), con la técnica que ofrece el programa, la CENTRIFUGACIÓN.

Se utilizará un programa sencillo de ejecución en MS-DOS. Este programa se ejecuta sobre la aplicación DOSbox. Debes descargar en tu disco duro y descomprimir el fichero DOSBOX.rar sobre el disco C:\ en una carpeta c:\dosprog\

En la figura siguiente puedes ver todos los ficheros y carpetas que se generan después de descomprimir DOSbox.

Para ejecutar DOSbox abre la carpeta DOSbox-0.73 y veras todos los ficheros que contiene, según se muestra en la siguiente figura.

Debes hacer doble click sobre el fichero dosbox.exe y se ejecutará la apertura de un entorno de MS-DOS en el que además está instalado un Windows 3.11. Debes moverte entre directorios con la sintáxis de comandos típica de MS-DOS.

El fichero ejecutable es "subcell.com". La pantalla inicial de ejecución de este programa se puede ver en la siguiente figura.

OBJETIVOS

Aprender el manejo del programa informático, eligiendo, como ejemplo, la purificación de peroxisomas y ensayando distintas condiciones para ello.

Nótese que el programa otorga una calificación determinada, en función de cuál haya sido la pureza alcanzada en el menor tiempo posible de purificación.

Como ayuda se incluyen en el apartado Apéndice algunos gráficos y tablas que aparecen en "Biological Membranes: a practical approach". IRL Press. Oxford. 1987.

Tutorial

A continuación se muestra un ejemplo de manejo del programa para la purificación de mitocondrias. Como bibliografía de referencia se recomienda el libro: "Biological Membranes: a practical approach", J.B.C Findlay & W.H. Evans, eds. IRL Press. Oxford. 1987. ISBN: 0-947946-83-7. Se debe ejecutar el programa SUBCELL.com en el ordenador local.

Después de la pantalla de presentación aparecerá la de instrucciones:

La BARRA ESPACIADORA y el ENTER son las teclas más importantes, ya que se van a utilizar para seleccionar las opciones y para ejecutarlas, respectivamente.

El programa ofrece la posibilidad de empezar desde el principio o a partir de un material previamente grabado.

Ahora deberemos seleccionar un tejido.

y una fracción subcelular

A la pregunta del recuadro le contestaremos que NO

El método de rotura elegido es

Durante el tiempo especificado

Elegimos el tipo de centrifugación

El modelo de rotor

El modelo de centrifuga

La temperatura de centrifugación

AHORA EL EJEMPLO DE AISLAMIENTO DE LAS MITOCONDRIAS NOS DA LA POSIBILIDAD DE INTRODUCIR PARÁMETROS QUE CONDUCEN A UNA BUENA PREPARACIÓN, O POR EL CONTRARIO, A UNA MALA PREPARACIÓN DE MITOCONDRIAS DE HÍGADO DE RATA

BUENA PREPARACIÓN

Velocidad de giro de la centrífuga

Tiempo especificado

Aparecerá un panel de centrífuga que nos indica el proceso

Obtendremos un sobrenadante y un sedimento, así como el número de mg de proteína en cada uno de ellos. Seleccionar un ensayo enzimático adecuado para determinar dónde se encuentra la fracción de interés. En nuestro caso será la succinato deshidrogenasa.

El resultado del ensayo enzimático determina que la mayoría de las mitocondrias se encuentran en el sobrenadante, habiendo separado los núcleos (en el sedimento). Recoger fracciones.

Seleccionamos el sobrenadante

Elegimos ver qué aspecto .tiene el sobrenadante en esta etapa intermedia. Elegimos la microscopía electrónica.

El aspecto del sobrenadante es el de la figura. Las mitocondrias aún no están bien aisladas, deberemos llegar a un segundo paso de purificación.

Ahora vamos al paso siguiente "Go to next step".

Nuestro sobrenadante lo sometemos a una centrifugación en gradiente de sacarosa

Con el tipo de rotor

Y con el modelo de rotor

Nos pedirá un volumen de sacarosa para llenar los tubos. Elegimos 25 ml

El balance de volúmenes nos invita a continuar o a elegir otro rotor

Establecemos el rango del gradiente

Establecemos la temperatura de centrifugación

Establecemos la velocidad

Establecemos el tiempo de centrifugación

Aparece el panel de la centrífuga

Y finalmente un resumen de la centrifugación que acabamos de hacer

Obtenemos un perfil de migración en el gradiente de sacarosa midiendo la absorbancia de las fracciones a 280 nm (verde). Cuando le pedimos que mida la actividad de la succinato deshidrogenasa en las fracciones, superpone una línea de color rojo, que nos indica en qué fracciones se encuentran las mitocondrias

Colectamos las fracciones de nuestro interés

El programa nos muestra las fracciones elegidas

Ahora queremos ver las microscopía electrónica de una de las fracciones elegidas: 115. Podemos apreciar que sólo hay mitocondrias.

También podemos pedir estadillos de purificación

Resultados para succinato deshidrogenasa

O pedir estadillos para actividad de DNA

Resultados para actividad DNA

O pedir estadillo para actividad RNA

Resultados para actividad RNA

MALA PREPARACIÓN

Velocidad de giro de la centrífuga

Tiempo especificado

Aparecerá un panel de centrífuga que nos indica el proceso

Obtendremos finalmente un sobrenadante y un sedimento. Seleccionar un ensayo enzimático adecuado para determinar dónde se encuentra la fracción de interés

En nuestro caso, el marcador de mitocondrias es la succinato deshidrogenasa

El resultado que nos devuelve el programa nos indica que la mayor parte de las mitocondrias están en el sedimento. Más adelante colectaremos las fracciones que nos interesan, esto es, los sedimentos.

También podemos determinar la actividad de otros marcadores, como DNA

O determinar la actividad de RNA

Colectamos las fracciones con "pool fractions"

Y elegimos la fracción concreta

Para evaluar el aislamiento de nuestra fracción subcelular, dispondremos de MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Pudiendo observar que el resultado final no es demasiado bueno, puesto que se aprecian no sólo mitocondrias, si no también núcleos, retículo endoplásmico liso y rugoso, peroxisomas, membrana plasmática, etc.